作者：张端珍　 来源：解放军总医院 2005-5-10 18:36:54 点击： 次 2005-5-10 18:36:54

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     生物旁路术是指成人在血管原性因子作用下从业已存在的血管以发芽方式形成侧枝血管的过程。随着载体和释放系统的改善，基因治疗缺血性心脏病即将步入临床。有效的基因治疗依赖于有效的基因转移，为达到表达的目的，外源基因必须进入细胞内，避开溶酶体酶和细胞核内酶的溶解等多道障碍，因此载体的转染能力在基因转移过程中至关重要。多种重组病毒和裸DNA均可将外源基因有效转染给宿主细胞，但心肌、血管内皮和平滑肌细胞的高分化状态使腺病毒在心肌基因转移中具有更大的优势。

 1．腺病毒的基本性质：腺病毒是一无包膜病毒，双链DNA长约36Kb，基因组由九个区组成，四个表达较早（E1-E4）称作早区，五个表达较晚（L1-L5）称作晚区，表达受细胞转录因子和E1区控制，E2区主要调节DNA复制，E3区基因产物与病毒逃避宿主免疫系统的清除有关，而E4区的产物参与病毒DNA复制、晚区基因表达和转录本拼接等活动。人腺病毒有49个血清型，仅2型(Ad2)和5型(Ad5)用作基因转移载体。腺病毒通过受体介导的细胞内摄途径进入细胞，核内体酸化后破裂，胞浆内病毒DNA于溶酶体降解之前释出，然后进入细胞核而变成附着体状态。核内体降解是腺病毒转染的主要特点，也是它能高效转染多种组织细胞的原因^[1]。

  2．腺病毒重组：第一代重组腺病毒是通过Ad2或Ad5基因组同源重组获得^[2]，即将腺病毒基因组左端部分切下并切除E1区，置入核定位信号、强健的启动因子和转基因，再在梭状质粒介导下与基因组右端部分组合而成。转基因表达由活性较强的病毒启动基因启动，一旦基因转移成功，启动基因便失去组织特异性而且不受其它因素调节。虽然大多将外源基因置入E1区，事实上可将其置入基因组的不同位点如E3区。因切除了E1A和E1B区碱基系列而不能复制，腺病毒的同源重组和繁殖均需在互补细胞株293或911细胞的辅助下进行^[3]。

  3．重组腺病毒作为心肌基因转移载体的优点：①既能感染复制状态的细胞，又能感染非复制状态的细胞^[4]，这一点对心肌细胞尤为重要，因为心肌细胞为终末分化细胞，正常动脉或粥样硬化甚至球囊损伤后动脉也只有极少的细胞呈分裂状态^[5-6]。虽然将质粒注入心肌能够复制并表达外源基因，但明显受心肌的病理生理状态影响^[7]，而逆转录病毒仅能感染处于复制状态的细胞^[8]。②理化性质比较稳定，能很容易获得高滴度病毒系，可达10¹¹-10¹²pfu/ml，比逆转录病毒高10⁴倍。③转染率高，复制缺陷腺病毒是目前转染率最高的病毒^[9]，质粒和逆转录病毒的转染率都远低于0.1％^[10-11]，而腺病毒体外血管内皮细胞感染效率达100％^[12],体内转染率可达15％-80％^[13],以相同外源基因为基准，腺病毒的转染效率是质粒140000倍^[1]。④转染后仍保持游离基因状态，外源基因以附着体方式存在，无插入诱变危险，而逆转录病毒（RV）和腺相关病毒（AAV）的基因组都需进入宿主细胞染色体中才能表达。⑤能容纳较大的外源性DNA片段（8Kb左右）。⑥细胞毒性较低，疫苗接种没有不良反应，应用比较安全。⑦转基因在靶细胞中的表达水平较高，为逆转录病毒载体的10-100倍。

  4．腺病毒载体的缺点：①转基因表达短暂，成年动物仅1-3周^[1]，但对于治疗缺血性心脏病来说则是其优点，因为2-4周的基因治疗已基本能达到目的，而持久稳定的转基因表达反而有可能促进其它副作用出现^[14-15]。②E1区去除后的腺病毒在高比率转染靶细胞时有少数病毒可以重新复制（可能与宿主细胞存在E1A样蛋白有关），转基因与293细胞株E1区进行同源重组时也可产生有复制能力的腺病毒，从而使宿主产生病毒感染^[16]。③在某些转基因产物的作用下，第一代腺病毒有可能引起强烈的细胞免疫反应而损伤靶细胞，其壳体蛋白可使80％以上的人产生体液免疫反应，导致转基因表达时间缩短且不能重复使用^[17]。④在正常动脉内局部释放腺病毒可诱导血管粘附分子的表达及新的内膜形成^[18]，目前尚不清楚这种现象能引起哪些不良作用。⑤大剂量可能产生细胞毒性作用。

二、活体感染

    不少实验对腺病毒介导的基因表达持续时间、有效性、特异性和安全性进行了评测。腺病毒介导的基因表达，在新生动物可长达12个月以上^[19]，但在成年动物表达短暂，一般为1-3周，与动物的种属和感染部位有关，注射后24-72小时为表达高峰^[15，20]。静脉注射重组腺病毒后首先被肝细胞清除并引起肝细胞及肝内皮细胞显著基因转移和表达，将编码萤虫素酶的基因以重组腺病毒为载体静脉注入小鼠体内，肝区的萤虫素酶活性占全身的99％^[21]，故以局部释放为宜。腺病毒载体局部灌注能引起血管局部的基因转移和表达，滞留于孤立血管腔内仅可引起内皮细胞感染而深层细胞不见感染，将内膜完整的动脉用球囊导管损伤后再注入腺病毒载体则选择性地在内膜受损处进行基因转移并形成新内膜层^[22]。Mark CA等将以腺病毒为载体的血管内皮生长因子121（VEGF121）cDNA直接注入猪缺血心肌内，腺病毒能有效感染心肌，表达VEGF121蛋白^[4]。Magovern CJ等将携带转基因的腺病毒载体直接注入犬心肌发现注射点周围1.5cm区域可测到转基因表达，对心功能和动物存活无明显影响，远程器官转基因产物活性不及注射心肌的0.1％^[23]。腺病毒浓度为0.7×10⁹～3.6×10⁹pfu/ml时，转基因产物与之呈正相关，虽然在病毒感染处见明显的中性粒细胞浸润，心室功能却未见负面影响^[1]。腺病毒虽然本身可引起Ⅰ型免疫反应，但却可安全应用于Ⅱ型T辅助细胞（Th2）介导的过敏性疾病患者，不仅能有效实现基因转移，而且能明显上调干扰素γ的表达，有助于过敏或自身免疫性疾病的控制^[24]。

     基因治疗最关键的是转基因必须在特定部位表达，要达到这种目的有两种方法：一是将载体释放在目标点附近，二是将载体与定向配基偶联使之自动导向目标点，后者尚在探索之中，故目前仍多用局部释放法。心肌血管基因局部释放多以直接心肌注射和经皮导管冠状动脉内释放两种方式实现。

 1.导管释放 现已设计出多种导管供冠状动脉内基因释放用，但均有待进一步改进，主要缺陷为载体可漏入体循环。经导管释放腺病毒的转染机制业已明确^[25]，Palasis等发现腺病毒以单纯的扩散机制转移入血管壁而与压力驱动无关，病毒溶液的浓度是影响转染率的主要因素，当溶液浓度为1.7×10¹¹ pfu/ml（该实验最高浓度）时基因转导率可达17.8％，溶液体积增加时转基因漏入侧枝血管相应增多，而透壁压对病毒转移率不仅没有促进作用，反而使转移率下降，而且压力过高可使血管壁细胞迅速而广泛死亡导致基因转导减少。病毒载体释放后确保1min内无血流影响至为重要，否则，血流的冲刷可使转染率明显降低，但2min后腺病毒转染即达到极限，继续延长时间转染率并不提高。活体经导管冠状动脉内释放的腺病毒转染率较低，将1×10⁹ pfu腺病毒于1min内经导管一次性释放于大鼠冠状动脉内转染率仅1％±0.5％，但用组胺灌注冠状动脉预处理可将转染率提高至30％±9％，用无钙缓冲液灌注可达67±8％^[26]。

  2．心肌内直接注射 虽然心肌内直接注射需行开胸手术，对腺病毒载体来说还受其表达的短暂性和炎症反应等限制，但优点也不容忽视。Lee LY等将猪做成慢性心肌缺血模型后，分别采用开胸心肌直接注射和经皮导管冠状动脉内释放两种方式给予以腺病毒为载体的VEGF121，检测发现心肌直接注射后心肌腺病毒基因组和VEGF-A蛋白水平比导管释放分别高33倍和9倍，而且，心肌直接注射可将腺病毒局限于给药部位，而导管释放腺病毒扩散至整个心脏^[15]。可见心肌直接注射能明显将转基因及载体局限于目标部位，减少载体及基因产物对全身系统的不利影响。

     腺病毒载体的主要缺陷在于可引起细胞免疫反应和体液免疫反应，其五角蛋白可引起细胞毒性T细胞反应^[27]，壳体蛋白可引起体液免疫反应^[28]，而其基因组则可引起炎症反应。宿主对腺病毒产生排斥反应的机制如下^[24]：（1）机体源于网状内皮系统的固有免疫力；（2）主组织相容性复合体（MHC）Ⅰ级限制性细胞毒性T细胞（CTL）反应；（3）由Ⅰ型和Ⅱ型T辅助细胞介导的细胞和体液免疫反应。网状内皮系统（巨噬细胞和枯否细胞）可使释于机体内的腺病毒基因组24h内丢失90％以上，继之抗原特异性MHCⅠ级限制性CD4⁺ 和CD8⁺ CTL将腺病毒基因组逐渐消除^[29]。此外，腺病毒感染可使Th2细胞产生中和抗体，阻止腺病毒与细胞膜受体结合和/或内在化腺病毒自核内体向细胞质易位，导致载体重复使用失效^[30]，大剂量腺病毒感染后再次给予相同载体还可激发强烈的迟发过敏反应。与动物不同，大部分人预先即存在抗腺病毒中和抗体，故给予重组腺病毒载体时的体液免疫反应强度决定于预先存在的抗腺病毒中和抗体浓度，而与载体剂量无关^[31]。CD4⁺ T细胞在腺病毒细胞和体液反应中起关键作用，CD4单克隆抗体可抑制原发和继发CTL反应，但不能抑制记忆B细胞的激活和IL-4的产生，故在机体业已存在腺病毒抗体的情况下给予CD4抗体并不能抑制体液免疫反应发生，因此如何抑制非CD4⁺ T细胞依赖性B细胞的激活成为抑制腺病毒体液反应的关键^[17]。目前主要从改良腺病毒本身结构和抑制机体免疫反应两个方面降低腺病毒的免疫原性，前者包括将所有病毒基因去除、病毒壳体蛋白覆盖、提高载体的趋向性和置入特异性启动子使转基因在抗原存在的细胞不表达等^[32-34]，后者则通过免疫反应细胞清除和使用免疫抑制剂而实现^[21]。据报道，腺病毒E4区的开放读码框（ORF）4能增强腺病毒的炎症反应与肝细胞毒性，而ORF3对ORF4具有抑制作用，因此将腺病毒的E1，E3和E4区去除但保留ORF3既能使其肝细胞毒性明显降低又能使转基因稳定表达^[35]。将第一代腺病毒切除28Kb编码区的第二和第三代腺病毒能阻止腺病毒残基的表达，减轻细胞免疫反应和炎症反应，从而延长转基因的表达，并能纳入大片段DNA^[36]。在此基础上又研制出两种更有发展前途的新腺病毒载体：一种叫通用定向载体，它通过改变病毒纤维（一种病毒壳体蛋白）而获得，将病毒纤维延展并与定向序列连接，从而改变其趋化性，通过这种处理，不仅其感染的细胞种类较腺病毒增多，而且对腺病毒不易感染的细胞其感染能力也提高了100倍之多^[37]。另一种腺病毒载体则将结构基因全部去除而仅保留感染靶细胞所必需的顺式作用元件及基因组两端的倒置反向重复DNA序列和包装信号顺序，不仅容量扩大，可容纳约36kb的外源基因，细胞毒性和免疫原性也大幅度减弱，从而使转基因表达时间大大延长（最长可达10个月以上）^[38]。此外，据报道将腺病毒五面体蛋白改建为十二面体蛋白后，腺病毒的免疫原性也大大减弱，据说可因此而达到重复使用的目的^[33]，将聚乙烯二醇与腺病毒壳体蛋白共价结合使之覆盖于壳体蛋白表面可以使腺病毒载体避开宿主抗体的中和反应但不影响其转染率，也可达到多次使用的目的^[39]。

    心肌细胞的高分化状态和腺病毒的感染特点决定了腺病毒在心肌基因转移中的载体地位。尽管存在免疫/炎症反应，但随着人们不断的改造，其免疫原性作用已明显减弱，到目前为止腺病毒载体已发展到第三代，进一步完善后在转染率和安全性方面均具有更大的优势。人们也认识到抗腺病毒中和抗体主要因五面体碱基蛋白和病毒纤维引起，而与基因组关系不大，将基因组改良和病毒壳体蛋白覆盖相结合的腺病毒载体有可能不产生免疫原性，这样，不仅基因表达时间延长，而且可重复使用，从而使腺病毒在心肌基因转移方面具有更大的优势，为缺血性心肌病的基因治疗提供坚实的基础。

 

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