血管发育的生理过程及分子机制_中国人民解放军总医院心血管内科

近十年来，人们对血管的发生和生成的研究及认识已有长足的进展。人体血管的发育形成是受各种促血管生长因子严格调控的过程。通过研究血管发生和生成，为临床治疗，尤其是肿瘤及缺血性疾病的治疗开辟了新的途径。

血管发生（Vasculogenesis）是指在胚胎发育阶段，中胚层源的成血管细胞（Angioblast）迁徙、聚集，相互联结形成早期原始的血管结构，这一过程形成人体的主要的大血管。在原肠胚形成后（约胚胎形成的20天）,中胚层细胞受纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factors ，FGFs)诱导分化为成血管细胞，它具有多能性，可分化为血细胞，也可在血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）及其特异受体VEGF-1的作用下分化为内皮细胞。内皮细胞的进一步分化、管腔化、基底膜至血管壁的形成涉及多种生长因子，包括VEGF、促血管生长素家族（Angiopoietins,Ang）、细胞黏附分子等其他促血管生长因子。

血管生成是在已有的血管基础上，内皮细胞以出芽的方式扩增、迁移并相互联结形成血管内膜腔，进而塑形成为新的血管，这一过程称为血管生成。血管生成形成人体的中、小血管及毛细血管。

动脉生成是已存在的血管丛侧枝小血管扩大形成较大血管的过程，不仅内皮细胞，平滑肌细胞也同时扩增。与血管生成不同，动脉生成主要由炎性介质和单核细胞参与。首先，血液动力学增加对小动脉血管壁的剪切力并激活内皮细胞，内皮细胞上调一氧化氮（Nitric oxide ,NO）的合成，同时释放单核细胞趋化蛋白1（Monocyte chemotactic protein-1 ,MCP-1) 、粒-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-cSF）,和转化生长因子（Transforming growth factor-ß, TGF-ß),在这些因子的刺激下，循环中的单核细胞黏附、侵入血管壁后，转化为巨噬细胞，并产生连接蛋白、蛋白多糖及蛋白酶以重塑细胞外基质，平滑肌细胞扩增、黏附，最终，血管成熟为肌性动脉.。

血管发生、血管生成、动脉生成是连续、复杂的过程，是细胞-细胞（内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、纤维细胞）之间，细胞和细胞因子之间在不同时空协同作用的结果。

血管生成不仅存在于胚胎发育时期，在整个生命周期均有重要的生理、病理意义。在成人，其涉及肿瘤、炎症、缺血性疾病、糖尿病视网膜病、创伤愈合等诸多病理过程而成为研究的重点。血管生成是肿瘤的生长的限速因素。无血管的肿瘤组织因氧气、养料、细胞代谢产物的扩散距离（约100～200mm）的限制而生长、扩散缓慢，常限制在1～2mm。当肿瘤组织细胞产生因子诱导血管生成，肿瘤生长进入进展期。通过抑制或阻断肿瘤血管生成，达到阻止肿瘤的生长、转移，甚至导致肿瘤细胞的凋亡，从而治疗肿瘤这一顽疾。对于缺血性疾病，如心肌梗死、肢体动脉闭塞等，通过促进血管生成，改善组织、器官血液灌注，维持器官的正常功能。

血管出芽是血管生成起始步骤，并由此向无血管组织延伸。可概括为九个步骤：①缺氧细胞合成释放促血管生长因子，如血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、促血管生长素-2（Angiopoietin,Ang-2）②血管外周细胞分离（血管失稳定）③内皮细胞释放蛋白酶降解细胞外基质④内皮细胞趋化迁徙。⑤内皮细胞扩增⑥内皮细胞管腔化⑦相邻管腔连接成环状⑧细胞外基质黏附塑形⑨周细胞、平滑肌细胞、纤维细胞重新聚集在新生血管周围。

血管出芽是正常的生理现象，发育中的器官和组织通过血管出芽达到血管化。在成年女性月经周期子宫及卵巢的周期变化、创伤愈合等过程中起重要作用。在正常状态下，促血管生长与抑制血管生长物质间的调控平衡维持着机体内环境的平衡，防止组织出现过血管化。当正常组织发生退变，内皮细胞将逐渐凋亡，血管周围支持组织消失。当组织发育时，在血液灌注（血流剪切力）的作用下，血管逐渐加固和稳定。

血管生成是由多种细胞因子和细胞参与的动态的、协调的过程。目前已发现有大约十几种血管生长因子和上百种血管抑制剂。缺血组织细胞旁分泌/自分泌的VEGF、碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factors bFGF）、肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF）、表皮生长因子（Epidermal growth factor,EGF）及脂类分子鞘氨醇-1-磷酸酯(sphingosine-1-phosphate,spp)、一氧化氮合酶 (Nitric oxide sythase,NOS)等均由促内皮细胞扩增的活性。

VEGF 最初称为血管渗透因子，由患肝细胞癌的豚鼠腹水中分离纯化，后来，在卵巢滤泡星形细胞癌分离纯化中鉴定出其内皮细胞丝裂原活性而被称为VEGF。目前已发现有五个同源体，VEGF-B、 VEGF -C、VEGF-D、VEGF-E及胎盘生长因子（Placenta growth factor ,PlGF),连同VEGF，构成VEGF家族。

VEGF是分子量为3.4～4.5KD同源二聚体糖化蛋白，对内皮细胞有较特异的丝裂原及趋化作用，对内皮细胞作用呈剂量依赖性，实验证实增加VEGF 的表达或基于外源VEGF均可增加血管密度。VEGF刺激NO的合成并激活其他相关促血管因子的表达，如诱导内皮细胞合成释放蛋白酶，降解细胞外基质以便于内皮细胞和周细胞的迁徙；维持内皮细胞的存活、增加单核细胞及中性粒细胞向血管外迁移促进动脉生成。

VEGF的作用由其内皮细胞表面受体VEGF-1（flt）和VEGF-2（flk）调节。VEGF-1由一个七个免疫球蛋白G样配体结合域、一个跨膜结构域和一个细胞内酪氨酸激酶功能域。其功能主要是调节内皮细胞的功能而非扩增。VEGF-2结构与VEGF-1相似，是内皮细胞主要的VEGF受体，在血管发育和内皮细胞扩增方面起主要作用。

VEGF的五个同源变异体（VEGF-B、 VEGF -C、VEGF-D、VEGF-E、,PlGF)功能各异。VEGF-B与 VEGF有44％的结构一致，与受体VEGFR-1结合，主要表达在心肌、骨骼肌和脑组织。VEGF –C与VEGF 有30％的结构一致，与受体VEGFR-3（Fms-like tyrosine receptor-4）组成的信号通路参与淋巴管的形；与受体VEGF-2结合参与血管生成。VEGF-D结构与VEGF -C 相似，结合及或受体VEGFR –2和VEGFR -3 ,不同于其他VEGFs ，它是唯一受c-fos调控的促血管生长因子，表明它与多种肿瘤的生长转移相关，尤其是淋巴管转移。VEGF-E由副豆病毒编码，哺乳动物中尚未鉴定出。PlGF与VEGF有46％的结构一致，主要在胎盘组织表达，其受体是VEGF-1，表明其作用是单核细胞激活和趋化。

Angiopoietins 血管生长素与其特异的内皮细胞表面受体Tie-2结合调节血管生成。目前发现的血管生成素家族共四个成员，其中Ang-1和 Ang-2研究较多。 Ang-1 作用主要是血管重塑、成熟及稳定。基因敲除 Ang-1和Tie-2 小鼠胚胎血管血管不能重塑、成熟，超微结构分析显示内皮细胞与细胞外基质及周围支持细胞连接障碍。过表达Ang-1则诱导较大较多的血管分支。Ang-1无内皮细胞扩增机管腔化的作用，但可促进血管出芽，与VEGF联合可增加血管的大小和数目，减少液体外渗。Ang-2与Ang-1的作用相反，主要诱导内皮细胞的凋亡和血管的退化。与VEGF共表达可促进内皮细胞的扩增、迁移，表明Ang-2使血管失稳定以利于血管出芽。

FGF家族 FGF是对多种细胞有丝裂原活性的细胞因子。FGF家族由23种多肽构成，包括aFGF、bFGF、FGF3-23，在血管、骨骼肌、神经系统发育，伤口愈合等生理病理过程中发挥作用。aFGF、bFGF已有较深入的研究，二者均由促血管生成的作用。aFGF、bFGF肽链中缺少信号序列疏水链，故大多由内质网/高尔基复合体合成释放于胞浆，或通过裂解释放于细胞外。由于与肝素高度亲和， FGF大多结合在细胞表面或细胞外基质。aFGF、bFGF均可刺激内皮细胞扩增、迁徙、出芽、形成管腔化。FGFs不仅刺激内皮细胞扩增，还对中胚层脊神经外胚层源细胞有丝裂原活性，包括成纤维细胞、平滑肌细胞、周细胞、软骨细胞和成骨细胞。

PDGF 血小板源性生长因子，分子量30KD,A链B链组成二聚体蛋白，有PDGF-AA、 PDGF-AB 、PDGF-BB三个亚型。体内多种细胞均可分泌PDGF，包括纤维细胞、成肌细胞、角质细胞、巨噬细胞和表皮细胞。内皮细胞表达PDGF及其受体。PDGF通过刺激VEGF的分泌和平滑肌细胞和周细胞的扩增和迁徙促进血管生成。

TGF-β 转化生长因子ß，是一同源二聚体蛋白，与特异的丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，调节血管发生。其细胞内介导分子为SMAD家族，目前共发现8个成员。TGF-β抑制内皮细胞的扩增和迁移，但可刺激平滑肌细胞扩增。目前认为TGF-β主要作用是调节血管的成熟及稳定。作为单核细胞趋化因子，TGF-β作用在于调节动脉生成。

Ephrin Eph属受体酪氨酸激酶，连同其配体Ephrins在胚胎发育、血管发生有重要作用。Eph家族是目前已知的最大的酪氨酸受体相关家族，至少有14个受体和8个配体。Ephrins分为两种，EphrinA结合于细胞表面，而EphrinB通过一穿膜结构域进入胞质。Eph受体也相应分为两种。Ephrin无促细胞扩增的活性，它主要调节细胞迁移、黏附。Eph/Ephrin信号系统在血管发生和血管生成中有广泛的作用，EphA主要参与VEGF诱导的内皮细胞存活、扩增、迁移及血管出芽；EphrinB2调节胚胎发育期的血管生成，主要表达在早期动脉细胞表面，其受体EphB4表达在早期的静脉组织,这种表达的差异早于循环系统的形成，表明Eph家族在动、静脉的特异性形成中起重要的作用。

SPP 脂类分子-1-磷酸鞘氨醇,是细胞膜鞘磷脂在鞘磷脂酶作用下的产物神经酰胺（Ceramide）的远端代谢产物，被视为介导细胞增殖的第二信使。近来的研究表明，SPP广泛参与了血管生成及动脉生成诸多环节，包括内皮细胞趋化、存活、扩增、管腔化形成与稳定、细胞表面抗原的分配、吸引平滑肌细胞促进血管成熟。

其他血管生长因子 在血管生成过程中，其他生长因子也具有相当的作用。基质金属蛋白酶（metalloproteases,MMPs）降解围绕在血管外的细胞外基质，以利于内皮细胞出芽、迁移。蛋白酶抑制物，如纤维蛋白酶原激活抑制剂-1（Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1）使细胞外基质的分泌增加，促进新生血管的成熟。VCAM、PECAM(血小板源性内皮细胞黏附分子)、VE-cadherin （血管内皮钙黏附素）等强化了血管壁细胞之间的紧密连接。VE-cadherin 尚可促进内皮细胞的存活。整合素α_Ⅴβ₃或α_Ⅴβ₅参与维持新生血管与基质间相互连接。TNFα具有很强的血管生成和动脉生成的生物活性，其受体TNFR1和TNFR2在内皮细胞表面均有表达。TNFα有促进内皮细胞存活和迁移的作用，并诱导其他血管生长因子的表达。TNFα的主要作用在于动脉生成，在动脉闭塞周围的巨噬细胞表面有TNFα的表达。

许多细胞因子具有抑制血管生成的作用，如激活的血小板、内皮细胞、纤维细胞分泌的血栓素-1和-2，血小板聚集产生的血小板因子-4均有抑制血管生成的功能。如此多的血小板源因子是人们认识到血小板可能对血管生成有非常重要的作用。一些内皮细胞抑制因子是某些蛋白因子的水解片段，血管他丁是纤溶酶原氨基端水解片段，内皮他丁是胶原XVIII的羧基端片段；TNFα及干扰素α有抑制血管生成的作用；一些无血管的组织，如软骨、玻璃体等含有抑制血管生成的成分。

缺氧是引起促血管生长因子上调的主要因素。肿瘤组织的增殖极为迅速，血管则无相应增多，随着肿瘤的生长，其内部组织细胞处于乏氧状态，受缺氧的刺激，肿瘤细胞分泌VEGF等血管生长因子，引起血管生成。缺氧可通过激活转录因子，缺氧诱导因子-1（Hypoxia inducible factor-1,HIF-1）促进VEGF、ANG-2、等血管生长因子的表达。HIF-1与VEGF启动子位点结合，启动mRNA的转录；在转录后水平，缺氧通过HuR mRNA结合蛋白维持VEGF mRNA的稳定性来增加VEGF的产量。HuR与mRNA的3^,非翻译区结合，可增加mRNA的稳定性。同时，5^,非翻译区也参加了这一过程。

除缺氧因素外，肿瘤细胞癌基因的激活和抑癌基因的失活也可能是一因素。癌基因V-SIC的激活通过上调HIF-1，在转录水平增加VEGF的表达；ras癌基因通过ras/MAPK途径调节VEGF的表达。

缺氧诱导的血管生成还涉及其他病变，如糖尿病视网膜眼病，因眼底血管的过度增生可致盲；高压氧是治疗新生儿缺血缺氧性脑病的方法之一，在高压氧环境中患儿视网膜血管发育不良，当离开高压氧舱后，缺氧可诱导患儿眼底血管增生。另一方面，缺血诱导的血管生成可减轻脑中风和心肌梗塞造成的缺血性损伤。

肿瘤的快速增殖、转移与血管生成关系密切。通过抑制肿瘤血管生成，阻断肿瘤的血液供应，可杀死肿瘤细胞，或者抑制其快速增殖和转移，为其他治疗手段创造条件。基因治疗由于靶向性强，、局部表达、副作用小，无反复用药、无耐药性等优点，而具有良好前景。导入血管生成抑制基因或降凋亡基因导入内皮细胞，可抑制肿瘤血管生成，达到治疗肿瘤的目的，这在实验中已得到证实。

经皮冠状动脉介入治疗（PCI）和冠状动脉旁路手术(CABG)是治疗冠状动脉粥样硬化的主要手段， PCI 和CABG的效果主要体现在血管内经≧2mm的心外膜血管，对≦2mm的血管基本无能为力，即使勉强获得即刻成功，远期效果也不理想。对药物治疗效果不理想，又不能介入治疗的患者，人们尝试用经皮或经胸肌光心肌血运重建术，在心腔和心肌间建立通道，但研究显示，激光通道维持时间有限，临床效果不尽人意。

血管生长因子中，VEGF、HGF等特异性针对内皮细胞的因子，在诱导血管生成方面有更大的优势，bFGF、TGF-ß等由于对平滑肌细胞同样具有丝裂原活性，可能因平滑肌增殖而加重动脉粥样硬化，而使用受限。

相当多的试验显示，通过基因导入VEGF、HGF等血管生长因子。可有效地促进缺血区域血管生成，增加血流灌注，改善症状。但是只有部分实验有直接的证据-血管造影，显示有较明显的侧枝循环建立，多数可能只是通过新生的毛细血管建立侧枝循环。由于缺血性疾病常是由运输性血管-肌性血管闭塞引起，这些毛细血管的远期效果如何尚不得而知。

过去的十年来人们血管发育的研究工作越来越深入，单就VEGF，通过Medline就可检索到5700多文献。血管的发育、成熟依赖于促血管生长因子、生物环境间的复杂的相互作用。在此基础上，新的治疗策略不断涌现。基因治疗以高效表达、副作用小等优势，有望成为常规的临床手段。